วิธีใหม่ "CLEVER" ช่วยเร่งการศึกษาทางวิศวกรรมและพันธุกรรมของ SARS-CoV-2 และสายพันธุ์ของมันการกลายพันธุ์อย่างรวดเร็วและการช่วยเหลือกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV-2) สายพันธุ์ต่างๆ โดยไม่ต้องทำการโคลนนิ่ง โดยใช้กลยุทธ์พันธุศาสตร์แบบย้อนกลับแบบใหม่ บาคาร่า

วิธีการทางพันธุศาสตร์แบบย้อนกลับที่สร้างขึ้นสำหรับ CoVs ถูกปรับให้เข้ากับ SARS-CoV-2 หลังจากเกิดขึ้น วิธีการที่ใช้ DNA ที่เรียกว่า Infectious subgenomic amplicons (ISA) ช่วยให้สามารถผสมชิ้นส่วน DNA ที่ทับซ้อนกันของทรานส์เฟกเข้าด้วยกันใหม่เป็นจีโนมแบบเต็มความยาว ซึ่งเพิ่งปรับให้เข้ากับ SARS-CoV-2การศึกษาและข้อค้นพบในการศึกษาครั้งนี้ นักวิจัยได้พัฒนาและอธิบายกลยุทธ์ตาม ISA ซึ่งเรียกว่า "ระบบที่ปราศจากการโคลนนิ่งและแลกเปลี่ยนได้สำหรับวิศวกรรมและกู้ภัยไวรัส" (CLEVER) โดยใช้ SARS-CoV-2ชิ้นส่วนจีโนมของ SARS-CoV-2 ที่ทับซ้อนกันแปดชิ้นถูกขยายและทรานส์เฟกเข้าไปในเซลล์ HEK293T การแพร่กระจายของผลลัพธ์ของไวรัสรีคอมบิแนนท์ (rCOV2) ได้รับการประเมินโดยการสังเกตผลไซโตพาทิก (CPE)

ทีมงานสังเกต CPE แรก 5-8 วันหลังการแพร่เชื้อ (DPT) พวกเขาไม่พบการปรับปรุงใด ๆ ในการฟื้นตัวของไวรัสด้วย co-transfection ของพลาสมิดที่แสดงนิวคลีโอไทด์หรือ messenger RNA (mRNA) นอกจากนี้ เมื่อมีการเพิ่มประสิทธิภาพ ชิ้นส่วนต่างๆ ก็ลดลงจากแปดเหลือสี่ส่วนเซลล์ที่ผลิตไวรัสหนึ่งเซลล์ต่อเซลล์ 11,000 เซลล์ถูกสังเกตโดยการทรานส์เฟกสี่ส่วน เทียบกับหนึ่งใน 160,000 เซลล์สำหรับการทรานส์เฟกชันแปดแฟรกเมนต์

นอกจากนี้ ทีมงานได้ทดสอบผลกระทบของการถ่ายเซลล์โดยใช้ชิ้นส่วนสี่ชิ้นต่อความเที่ยงตรงของการสร้างใหม่ โดยเปรียบเทียบความสามารถในการจำลองแบบระหว่างไวลด์ไทป์ไอโซเลตและไวรัสรีคอมบิแนนท์ ขนาดและรูปร่างของไวรัสชนิดไวด์และ rCOV2 ที่สร้างจากชิ้นส่วนสี่ชิ้น (rCOV2-4fr) มีความคล้ายคลึงกันเราแนะนำการวิเคราะห์ระยะทางจีโนมระหว่าง Bat Coronavirus RaTG13 และ SARS-CoV-2 เผยให้เห็นต้นกำเนิดของ COVID-19 หลายจุด

การวิเคราะห์ระยะทางจีโนมระหว่าง Bat Coronavirus RaTG13 และ SARS-CoV-2 เผยให้เห็นต้นกำเนิดของ COVID-19 หลายจุดการตรวจจับดินถล่มแบบแอคทีฟจากข้อมูล Sentinel-1 และเทคโนโลยี InSAR ในเมืองโจวฉู มณฑลกันซู่ ทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีนวิธีการเชิงตัวเลขสำหรับการจำลองการกระแทกของธาตุหายากในการประมาณของอุทกพลศาสตร์พลิกเฟสแม้ว่าจลนพลศาสตร์การจำลองแบบของ rCOV2-4fr จะเผยให้เห็น titers ที่ลดลงภายใน 24 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ แต่ titers นั้นเทียบได้หลังจากการติดเชื้อเป็นเวลานาน ใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านเพื่อเปรียบเทียบความสมบูรณ์ของไวรัส rCOV2-4fr แยกไม่ออกจากไวรัสชนิดป่าทีมงานระบุว่ากระบวนการสร้างใหม่สามารถทำซ้ำได้ด้วยการกู้คืนไวรัสจากเซลล์ HEK293, HEK293T, BHK-21 และ CHO ที่ประสบความสำเร็จจากนั้น ทีมงานได้ปรับกระบวนการขยายสัญญาณให้เหมาะสมโดยใช้กฎบางอย่าง เช่น การใช้อินพุตเทมเพลตสูงหรือพอลิเมอเรสที่มีความเที่ยงตรงสูง การจำกัดรอบการขยายสัญญาณที่ 25 รอบ และการรวมปฏิกิริยาการขยายสัญญาณแบบขนานแปดครั้ง

นักวิจัยได้แนะนำไซต์เครื่องหมายพันธุกรรม (การจดจำ Sal I) เพื่อแยกความแตกต่างของไวรัสรีคอมบิแนนท์จากการปนเปื้อนโดยบังเอิญกับเชื้อที่แยกได้ทางคลินิก เครื่องหมายนี้มีอยู่ในไวรัสที่สร้างใหม่ทั้งหมด บาคาร่า 888

ยิ่งไปกว่านั้น ทีมงานได้แนะนำลำดับยีนสไปค์ของสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ในขณะที่รักษา/รักษาลำดับสายพันธุ์สายพันธุ์บรรพบุรุษ (หวู่ฮั่น) ที่เหลือไว้เป็นพื้นหลังลำดับเป้าหมาย (ยีนสไปค์แปรผัน) ถูกขยายโดยใช้พลาสมิดเชิงพาณิชย์หรือในบ้าน อนุภาคไวรัส Chimeric ได้รับการช่วยเหลือและยืนยันโดยการจัดลำดับไวรัสไคเมอริกที่ได้รับการช่วยเหลือหรือสายพันธุ์ที่แยกได้ทางคลินิกของสายพันธุ์หวู่ฮั่นและสายพันธุ์ Omicron BA.1 หรือ BA.5 อยู่ภายใต้ตัวอย่างซีรั่มจากผู้ที่ได้รับวัคซีน ไทเทอร์ที่ทำให้เป็นกลางสูงสุดเทียบกับสายพันธุ์หวู่ฮั่น Titers มีความคล้ายคลึงกันระหว่างไวรัส chimeric และ homologs ที่เกี่ยวข้อง 

ขั้นตอนการขยายสามารถใช้ประโยชน์สำหรับการกลายพันธุ์โดยไม่ต้อง สังเคราะห์ de novoหรือการโคลน ทีมออกแบบคู่โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่แนะนำ N501Y หรือ G614D ชิ้นส่วนที่มีการกลายพันธุ์ของจุดเหล่านี้ถูกแปลงร่วมกับชิ้นส่วนอื่น ๆ ที่จำเป็นสำหรับการประกอบจีโนมลำดับยืนยันการแนะนำการทดแทนที่ประสบความสำเร็จ นอกจากนี้ พวกเขายังออกแบบไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์เพื่อลบ ORF3a ซึ่งได้รับการยืนยันโดยการจัดลำดับและอิมมูโนบล็อตนอกจากนี้ ทีมงานประสบความสำเร็จในการแนะนำลำดับแปลกปลอมเฉพาะไซต์ (แท็กสามธง) ใกล้กับจุดสิ้นสุดคาร์บอกซีของ ORF8 นอกจากนี้ นักวิจัยยังปรับเปลี่ยนกลยุทธ์เล็กน้อยเพื่อช่วยเหลือ rCOV2 จากเชื้อทางคลินิกโดยตรง

พวกเขาโคลนองค์ประกอบการแสดงออกของยูคาริโอตที่จำเป็นสำหรับการถอดรหัสจีโนมของไวรัสที่ขึ้นกับดีเอ็นเอหรือพลาสมิดแบบกำหนดเองที่ได้รับในเชิงพาณิชย์ซึ่งเข้ารหัสองค์ประกอบเหล่านี้ องค์ประกอบทั้งหมดถูกรวมเข้าด้วยกันเป็น DNA เชื่อมโยงเดียวหนึ่งร้อยคู่เบสของไวรัล 3" และ 5" ภูมิภาคที่ไม่ได้แปล (UTR) ขนาบข้างชิ้นส่วนลิงเกอร์ที่ด้านใดด้านหนึ่ง มันถูกออกแบบมาเพื่อการรวมตัวกันใหม่เป็นผลสำเร็จในผลิตภัณฑ์ DNA แบบวงกลม ชิ้นส่วนจีโนมของ SARS-CoV-2 แปดชิ้นได้รับการขยายในขั้นตอนเดียวจาก RNA ของไวรัส แอมพลิคอนถูกแปลงร่วมกับชิ้นส่วนลิงเกอร์ ไวรัสที่มีชีวิตได้รับการช่วยเหลือในเจ็ด DPTสิ่งนี้ทำให้สามารถช่วยเหลือไวรัส chimeric ต่างๆ ได้โดยไม่ต้องใช้การโคลนแบคทีเรีย จีโนมของเชื้อที่แยกได้ทางคลินิกของสายพันธุ์ SARS-CoV-2 Wuhan และสายพันธุ์ Omicron (BA.1 และ BA.5) ได้รับการขยาย

ชิ้นส่วนที่มียีนสไปค์ถูกแลกเปลี่ยนกับชิ้นส่วนที่สอดคล้องกันซึ่งมียีนสไปค์ที่แปรผัน ดังนั้น ไวรัสไคเมอริกที่มียีนสไปค์ต่างกันจึงถูกสร้างขึ้นในที่สุด ทีมช่วยเหลือไวรัสรีคอมบิแนนท์จาก Omicron BA.5 ที่แยกได้ทางคลินิกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แต่ด้วยไพรเมอร์แนะนำการลบ ORF3a ในทำนองเดียวกัน recombinant XBB.1.5 ที่มีการลบ ORF3a ได้รับการช่วยเหลือ ดังนั้น ผู้เขียนสามารถสร้างการลบการกลายพันธุ์ของสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ที่เกิดขึ้นใหม่ได้ในขั้นตอนเดียว

ข้อสรุปโดยสรุป วิธีการของ CLEVER นั้นมีความหลากหลายสูงด้วยการประยุกต์ใช้อย่างกว้างขวางสำหรับการกลายพันธุ์อย่างรวดเร็วหรือการช่วยเหลือ SARS-CoV-2 โดยไม่ต้องทำการโคลนนิ่ง ผู้เขียนได้แสดงให้เห็นถึงความยืดหยุ่นของเทคนิคนี้โดยแนะนำการกลายพันธุ์ของจุด ลำดับแปลกปลอม หรือการลบ ORF3aนอกจากนี้ ด้วยการหมุนเวียนภายในเซลล์โดยใช้ชิ้นส่วนตัวเชื่อมโยง พวกเขาแนะนำการลบ ORF3a และช่วยเหลือไวรัสรีคอมบิแนนท์ที่ทำงานได้ในขั้นตอนเดียวจาก RNA ของไวรัส